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　　（2）为了进一步确定miR-6077的临床相关性，作者研究了其在肿瘤样本中的表达，样本为CDDP/PEM 抗性组 (n = 10) 和敏感组 (n = 10)。结果发现CDDP/PEM 耐药组的肿瘤中miR-6077水平显著高于敏感组织，而在淋巴细胞或其他非肿瘤细胞中，miR-6077的水平远低于肿瘤细胞中的水平，在测量 miR-6077在评估肿瘤对CDDP/PEM治疗的反应中的预测值时，发现 miR-6077 水平的受试者ROC曲线，这些数据表明miR-6077与LUAD患者的 CDDP/PEM耐药相关。

　　（3）为了进一步深入了解miR-6077在调节 LUAD耐药性中的作用机制，作者利用pull-down实验和RNA-seq 来寻找A549 细胞系中与miR-6077结合的候选基因。基于来自结构和功能分析的证据，作者筛选了 CDKN1A和KEAP1以进行进一步的实验验证。miR-6077的过表达显著抑制LUAD中CDKN1A和KEAP1在mRNA和蛋白质水平上的表达。表明由CDDP/PEM处理引起的CDKN1A和KEAP1表达增强被miR-6077部分消除。进一步使用双荧光素酶报告基因检测证明CDKN1A和KEAP1是miR-6077的直接下游靶标。

　　后续作者进一步研究了miR-6077通过靶向抑制CDKN1A和KEAP1导致CDDP/PEM抗性的下游细胞信号通路。针对CDDP/PEM处理或未处理的A549细胞的转录组测序差异基因富集分析显示，在 CDDP/PEM处理后，一系列参与细胞周期和铁死亡相关生物学途径的基因，包括细胞周期G2/M转变、脂肪酸氧化的调节和氧化应激的反应均显著失调。为了消除来自位于肿瘤微环境中的其他非癌细胞的肿瘤内异质性，作者使用单细胞转录组测序来精确描述 CDDP/PEM治疗诱导的转录改变。经过质控后治疗组共38599个细胞，未治疗组共32372个细胞用于下游分析。降维聚类和marker基因分析识别肿瘤细胞（EPCAM 和SOX4）后进行两组间GSEA分析，同样发现细胞周期和铁死亡相关通路，这些结果表明，这两种途径在LUAD细胞中被CDDP/PEM处理激活。

　　后续作者一方面对miR-6077进行异位表达，发现其能够抵消CDDP/PEM处理后肿瘤细胞G2/M 停滞的异常细胞周期进展，这些结果暗示miR-6077保护CDDP/PEM处理的LUAD细胞免受细胞周期停滞，导致耐药性和产生和细胞存活；另一方面针对铁死亡途径，作者首先验证CDDP/PEM对肿瘤细胞增殖和活力的抑制作用是由铁死亡引起，后续同样通过miR-6077的外源过表达，表明miR-6077可以缓和肿瘤细胞的铁死亡效应。总之，这些结果表明，除了经典的细胞死亡形式，如细胞凋亡和坏死外，CDDP/PEM可以通过铁死亡诱导细胞毒性，而miR-6077部分消除了这种效应并使 LUAD 细胞对CDDP/PEM治疗脱敏。

　　为了确定CDKN1A在miR-6077诱导的G2/M阻滞衰减和CDDP/PEM抗性中的介导作用，作者在LUAD细胞系中过表达或敲低CDKN1A，细胞毒性和克隆形成实验表明，CDKN1A过表达抵消了miR-6077诱导的CDDP/PEM脱敏作用。具体机制方面，miR-6077对CDKN1A 的抑制作用导致CDK1及其活性形式p-CDK1-Thr161的上调，而这种作用通过CDKN1A恢复得以抵消，此外，当与PEM联合使用时，CDKN1A的抵消作用也使细胞对卡铂和奥沙利铂敏感。总之，这些结果表明miR-6077以CDKN1A依赖的方式以及 CDKN1A的下游细胞周期调节使LUAD细胞对CDDP/PEM具有耐药性。

　　为了验证miR-6077靶向KEAP1的效应，作者在LUAD 细胞系中回复表达KEAP1，结果发现KEAP1上调可以消除miR-6077 的影响，导致在CDDP/PEM存在下抑制细胞活力和克隆形成能力，中和miR-6077对CDDP/PEM引起的铁死亡的保护作用。此外，WB显示miR-6077 诱导转录因子NRF2及其下游靶基因SLC7A11和NQO1的表达，这两者都有助于抗铁死亡，而这种效应被回复KEAP1而消除，在LUAD细胞中过表达KEAP1也证实了上述结果。总的来说，这些研究结果表明，miR-6077通过抑制KEAP1赋予LUAD细胞CDDP/PEM抗性，从而保护细胞免受铁死亡。

　　首先作者将miROFF-6077抑制剂转染到H1299-CDDP/PEM 细胞进行miR-6077敲降，发现CDKN1A 和 KEAP1 的表达上调，单细胞数据也表明与未接受新辅助化疗的细胞相比，来自CDDP/PEM治疗组的细胞群的特征是CDKN1A和KEAP1的表达更高。另外，miR-6077 敲低可以降低 H1299-CDDP/PEM 的化学抗性，并加重化疗诱导的细胞周期停滞和铁死亡，这些结果与上述结果一致，证明 miR-6077 通过直接与CDKN1A 和 KEAP1结合来调节细胞周期进程和铁死亡，从而有助于 LUAD 对 CDDP/PEM 的抗性。